¶ Дизайн праймеров
Инструмент для подбора пар ПЦР-праймеров на основе заданной последовательности ДНК с использованием движка Primer3 и индивидуальных буферных пресетов (учёт концентраций солей, dNTP, полимеразы). Результаты ранжируются по стандартному штрафу (GS).
¶ 🔬 Параметры ввода
-
Последовательность ДНК (5′→3′)
Целевой участок для подбора праймеров в формате (A, T, G, C). Можно вставлять в формате FASTA — заголовок будет проигнорирован. -
Буферный пресет
Предустановленные значения концентрации солей (Na⁺, Mg²⁺) и dNTP, необходимые для корректного расчета термодинамики отжига
Основные параметры ввода
-
Размер продукта (п.н.)
Диапазон длины ампликона от минимального до максимального значения. Оптимально для ПЦР в реальном времени — 100–200 п.н.
150–300 -
Длина праймера (п.н.)
Границы длины олигонуклеотидов. Короткие праймеры менее специфичны, слишком длинные склонны к образованию вторичных структур.
18–27 -
Оптимум длины (п.н.)
Идеальная длина, к которой стремится алгоритм. Отклонение от этого числа на каждый нуклеотид увеличивает «штраф» пары.
20 -
Диапазон Tm (°C)
Допустимые границы температуры плавления праймеров. Важно для обеспечения специфичного связывания с матрицей.
57–63 -
Оптимум Tm (°C)
Целевая температура плавления. На основе этого значения рассчитывается рекомендуемая температура отжига в цикле ПЦР.
60 -
Итерации
Количество пар праймеров с наилучшими показателями, которые будут отображены в итоговом списке.
10 -
GC clamp (3' G/C)
Количество оснований G или C на 3'-конце. Наличие «зажима» обеспечивает более стабильный старт полимеризации.
1
Дополнительные параметры ввода
-
Диапазон GC (%)
Процентное содержание гуанина и цитозина в последовательности. Оптимально поддерживать в пределах 40–60% для стабильного отжига.
40–60 -
Макс. разница Tm
Предельно допустимое различие в температуре плавления между прямым и обратным праймерами в одной паре.
2,0 -
Poly-X
Максимально допустимая длина мононуклеотидного повтора (например, AAAA). Длинные повторы снижают специфичность и вызывают ошибки полимеразы.
4 -
Целевая область ПЦР продукта
Конкретные координаты внутри последовательности, которые обязательно должны быть перекрыты итоговым ампликоном.
100-150 -
Исключенные области для поиска праймеров
Координаты участков, на которые нельзя накладывать праймеры (например, из-за известных мутаций или сложных повторов). Вводить диапазоны с новой строки.
50-6080-81
¶ 🔬 Параметры результатов
- GS (General Score)
Штраф рассчитывается на основе отклонений от заданных оптимумов пользователя по данным primer3 (Tm, GC, длина).
Чем меньше значение — тем качественнее подобрана пара.
Для валидированных буферов необходимо корректировать оптимум Tm, так как происходит перекалибровка primer3 результатов, поэтому оптимумы могут не совпадать с заданным параметрам.
Для валидированных буферов смотреть на столбец P3S, так как GS пригоден только для невалидированных буферных систем.
- P3S (Predicted Primer Performance Score)
Расширенный штрафной балл, который, в отличие от GS, учитывает риск образования димеров, шпилек и стабильность 3'-конца. Для работы с валидированными буферными системами следует ориентироваться на значение P3S, так как он точнее прогнозирует чистоту реакции без побочных артефактов в оптимизированных условиях.
Чем меньше значение — тем выше специфичность и меньше побочных эффектов.
📊 Расшифровка других заголовков
-
Forward (5'→3')
Нуклеотидная последовательность прямого (левого) праймера. Отображается в стандартном направлении от 5'-конца к 3'-концу.
GGTGGTCTCCTCTGACTTC... -
bp (Forward)
Длина прямого праймера в нуклеотидах. Значение должно находиться в пределах заданного диапазона (обычно 18–27 п.н.).
20 -
Tm (Forward)
Температура плавления прямого праймера в градусах Цельсия. Рассчитана с учётом концентрации солей и dNTP из выбранного буферного пресета.
60.1 -
GC% (Forward)
Процентное содержание гуанина и цитозина в прямом праймере. Влияет на стабильность отжига и специфичность связывания.
55.0% -
Reverse (5'→3')
Последовательность обратного (правого) праймера. Также приводится в направлении 5'→3', соответствующем синтезу.
TTCAGAGGAGACCACCACC... -
bp (Reverse)
Длина обратного праймера в нуклеотидах.
20 -
Tm (Reverse)
Температура плавления обратного праймера. Для стабильной работы ПЦР она должна быть максимально близка к Tm прямого праймера.
59.8 -
GC% (Reverse)
Доля G/C нуклеотидов в составе обратного праймера.
50.0% -
PCR bp
Размер получаемого ПЦР-продукта (ампликона) в парах нуклеотидов. Это расстояние на матрице между 5'-концами пары праймеров.
215 -
PCR GC%
Усреднённое содержание G/C во всей последовательности продукта. Справочный показатель для оценки сложности денатурации итогового фрагмента.
52.4%
¶ 📚 Источники литературы
- SantaLucia, J. (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest‑neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(4), 1460–1465.
- Allawi, H. T., & SantaLucia, J. (1997). Thermodynamics and NMR of internal G·T mismatches in DNA. Biochemistry, 36(34), 10581–10594.
- Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., & Walder, J. A. (2008). Effects of sodium ions on DNA duplex oligomers: improved predictions of melting temperatures. Biochemistry, 47(19), 5336–5353.
- von Ahsen, N., Wittwer, C. T., & Schütz, E. (2001). Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg²⁺, dNTP, and Na⁺ concentrations. Biotechniques, 31(5), 1156–1161.
- Cavaluzzi, M. J., & Borer, P. N. (2004). Revised UV extinction coefficients for nucleoside‑5′‑monophosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Research, 32(2), e13.
- Rozen, S., & Skaletsky, H. (2000). Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology, 132, 365–386.
- Untergasser, A., et al. (2012). Primer3—new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research, 40(15), e115.
¶ Сведения о калибровке по буферу
- ✅ Значение экспериментально подтверждено; расчет откалиброван по буферным системам производителей с применением метода Owczarzy et al. 2018.
- Без галочки Значение рассчитано математически; экспериментальная проверка и калибровка не проводились.
¶ Ваш бренд в статусе ✅ VALIDATED
Мы приглашаем производителей реагентов и лаборатории к партнерству для проведения экспериментальной валидации ваших систем. По результатам тестов калибровки будут интегрированы в общую базу.
¶ Как цитировать
Sleptcov A. Genomicon Primer Designer: A Precise PCR Primer Design Tool with Buffer-Specific Thermodynamic Calibration (v1.0). Zenodo. 2026. DOI: 10.5281/zenodo.19758860. (Accessed: ).
