В молекулярной биологии точность приготовления праймеров определяет успех амплификации. Ошибки на этапе разведения ведут к неспецифическому отжигу, образованию димеров или полному отсутствию продукта.
Большинство синтетических олигонуклеотидов поставляются в виде лиофилизата (белый налет или «таблетка» на дне пробирки).
Самый простой способ получить стоковый раствор с концентрацией 100 мкМ (100 пмоль/мкл) — это использовать количество наномолей (nmol), указанное в паспорте синтеза.
Формула «Правило десяти»:
Чтобы получить 100 мкМ, нужно добавить объем растворителя (в мкл), равный количеству наномолей, умноженному на 10.
Пример: В паспорте указано 24.5 nmol.
Добавьте 245 мкл буфера.
Разбор «на пальцах»: Почему мы умножаем nmol на 10?
Весь секрет в том, что целевая концентрация 100 мкМ — это то же самое, что 100 пмоль в 1 мкл. Чтобы её получить, нужно просто соотнести общее количество вещества с объемом.
- Что имеем: В паспорте праймера указаны наномоли (nmol). В 1 нмоль всегда ровно 1000 пикомоль (pmol).
- Пример: В паспорте написано 30 nmol. Значит, в пробирке 30 000 pmol вещества.
- Цель: Нам нужно распределить эти 30 000 pmol так, чтобы в каждом микролитре было по 100 pmol.
- Расчет: Делим общее количество на желаемую густоту:
- 30 000 / 100 = 300 мкл.
Итог: Мы взяли число 30 с паспорта и получили объем 300. То есть просто умножили на 10. Этот лайфхак работает для любого количества наномолей.
Рабочая концентрация праймеров для постановки ПЦР обычно составляет 10 мкМ. Это позволяет удобно дозировать праймер в реакционную смесь.
Для получения 10 мкМ из 100 мкМ стока:
Важно: Храните основной сток (100 мкМ) при -20°C и избегайте многократного замораживания-размораживания. Рабочие растворы (10 мкМ) можно хранить в холодильнике (+4°C) в течение 1-2 недель. Можно и больше, но зачем.
В протоколах ПЦР финальная концентрация каждого праймера в смеси обычно варьируется от 0.2 до 0.5 мкМ (uM).
Используйте формулу , где:
Пример:
мкМ мкМ мкл
мкл
Количество в пмолях:
Помните, что 1 мкМ = 1 пмоль/мкл. Если в 25 мкл смеси финальная концентрация 0.2 мкМ, то общее количество праймера в пробирке составит:.
- Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Dieffenbach, C. W., & Dveksler, G. S. (2003). PCR Primer: A Laboratory Manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Integrated DNA Technologies. (2011). Resuspending and Diluting Primers.
Sleptcov A. Genomicon Lab Recipes: Interactive Protocols and Safety Data for Laboratory Reagent Preparation (v1.1). Zenodo. 2026. DOI: 10.5281/zenodo.19759566. (Accessed: ).