После выделения ДНК необходимо оценить два параметра: концентрацию (сколько вещества) и чистоту/целостность (насколько оно пригодно для работы). Использование только одного метода часто приводит к ложным результатам.
Метод основан на способности азотистых оснований поглощать ультрафиолет при длине волны 260 нм.
Нанодроп как эпоним в молекулярной биологии
Подобно тому как слово «Ксерокс» (Xerox Corporation) стало нарицательным для всех копировальных аппаратов, NanoDrop (оригинальный бренд компании Thermo Fisher Scientific) превратился в эпоним.
В лаборатории: Фраза «померь в нанодропе» сегодня используется молекулярными генетиками для обозначения любого измерения концентрации нуклеиновых кислот методом микрообъемной спектрофотометрии, даже если в работе используется прибор другого производителя (например, Eppendorf BioSpectrometer или Implen NanoPhotometer).
Суть технологии: Эпоним закрепился благодаря революционному методу «натянутой капли». В отличие от классических кювет, здесь капля образца (0.5–2 мкл) удерживается поверхностным натяжением между двумя оптическими волокнами, формируя оптический путь.
Культурный след: В современных статьях и протоколах можно встретить термин «Nanodrop-level purity», что де-факто означает оценку чистоты по соотношению 260/280, ставшую стандартом именно благодаря массовости этих приборов.
Главный минус: Спектрофотометр не отличает дцДНК от оцДНК, РНК, свободных нуклеотидов и деградировавших фрагментов. Если образец сильно деградирован, NanoDrop покажет высокую концентрацию, которая на самом деле является «мусором».
Используются специфические красители, которые светятся только при связывании с двухцепочечной ДНК (днДНК).
Кьюбит как стандарт селективности
Название Qubit (бренд Invitrogen/Thermo Fisher) также стало нарицательным в лабораторном сленге. Когда сотрудник говорит «померить на кьюбите», он подразумевает использование любого компактного флуориметра для специфического количественного анализа.
Смысловое различие: Если «нанодроп» в лабе ассоциируется с быстрой проверкой чистоты, то «кьюбит» — это синоним доверенной концентрации. Фраза «Какая концентрация по кьюбиту?» обычно звучит тогда, когда нужно узнать реальное количество дцДНК перед дорогостоящими этапами (NGS-библиотеки, трансфекция), игнорируя «шум» от РНК и белков.
Технологический сдвиг: Эпоним закрепился благодаря переходу от измерения «всего подряд» (поглощение при 260 нм) к использованию специфических флуоресцентных зондов. В отличие от спектрофотометрии, здесь результат зависит не от физики капли, а от химии красителя.
Проверка «на вшивость»: В протоколах часто встречается сравнение двух технологий — если данные «по нанодропу» и «по кьюбиту» расходятся более чем в 2 раза, образец считается грязным, независимо от того, приборы каких брендов стоят на столе.
Преимущество: Высокая селективность. Вы получаете концентрацию именно ДНК, игнорируя примеси.
Недостаток: Высокая селективность. Вы получаете именно концентрацию ДНК, не замечая примеси.
Единственный доступный метод визуальной оценки целостности (integrity) ДНК.
| Параметр | NanoDrop (УФ) | Qubit (Флуориметрия) | Гель-электрофорез |
|---|---|---|---|
| Что измеряет | Общее поглощение | Только дцДНК | Целостность (размер) |
| Точность | Низкая (завышает) | Высокая | Субъективная |
| Чувствительность | от 2 нг/мкл | от 0,01 нг/мкл | от 10–20 нг в полосе |
| Качество | Видит соли/белки | Не видит примеси | Видит деградацию |
- Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Simbolo, M., et al. (2013). DNA Qualification Strategy for Next Generation Sequencing of Clinical Samples. PLoS ONE, 8(9), e72671.
- Integrated DNA Technologies (IDT). (2016). Interpretation of Nucleic Acid 260/280 and 260/230 Ratios.
- Thermo Fisher Scientific. (2010). NanoDrop Spectrophotometers: Nucleic Acid Purity Ratios.
- O'Neill, M., et al. (2011). Comparison of NanoDrop and Qubit Quantification of DNA Yield from Human Biopsies. Journal of Clinical Pathology.
- Gallagher, S. R. (2011). Quantitation of DNA and RNA with Absorption and Fluorescence Spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology.
- Haque, K. A., et al. (2003). Performance of three nucleic acid quantification methods: spectrophotometry, fluorometry, and real-time PCR. BMC Biotechnology.
- Koetsier, G., & Cantor, E. (2019). A Practical Guide to Analyzing Nucleic Acid Concentration and Purity. New England Biolabs (NEB).
- Nakayama, G. R., et al. (1997). Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. Journal of Immunological Methods. (Основы флуоресцентной детекции).
Sleptcov A. Genomicon Lab Recipes: Interactive Protocols and Safety Data for Laboratory Reagent Preparation (v1.1). Zenodo. 2026. DOI: 10.5281/zenodo.19759566. (Accessed: ).